Дифференциальные среды микробиология. Дифференциально-диагностические (цветные) питательные среды. Элективные питательные среды

Для отличия одних видов бактерий от других на основании их ферментативной активности применяются дифференциально-диагностические среды . Например, среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среда Олькеницкого. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбражи­вания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких сре­дах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина - в черно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или па­лочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды ос­танется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэто­му колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задер­живающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут-сульфит агар - это дифференциально-диагностическая среда, при­меняемая главным образом при диагностике сальмонеллезов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл окрашиваются в черный цвет. Диф­ференциально-диагностические среды Гисса («пестрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полу­жидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде. В пробир­ку с жидкой средой Гисса помещен стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный уг­левод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных про­дуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появят­ся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырек газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежу­точных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды, Применяются также комбинированные среды, содержа­щие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого - трехсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лакто­зой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1 %), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит на­трия и индикатор. Среду после стерилизации в расправленном виде наливают в пробирку так, чтобы получился столбик и ско­шенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содер­жатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров), изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глю­козы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырь­ков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с об­разованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом проис­ходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патоген­ные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бак­терий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чер­ного цвета.

Для экспресс-метода определения ферментативной актив­ности микроорганизмов применяются микротестсистемы и сис­тема индикаторных бумажек (СИБ). Микротестсистема представ­ляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек. Ячейки содержат высушенные пит среды с углеводами и индикаторами рн. В каждую ячейку засе­вают взвесь культуры бактерий определенной густоты. В контроль­ные ячейки наливают физ. раствор. Результат учитывают после 3-4-часовой инкубации в термостате по изменению цвета инди­катора.Системы индикаторных бумажек (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерии представляют собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытой защитной плен­кой из поливинилового спирта и содержащей определенный суб­страт и индикатор. В пробирке с физиологическим или буферным раствором вносят полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси, затем обожженным пинцетом помещают в диски. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Результат учитывают по изменению цвета индикатора. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновремен­но определить подвижность. Во всех пробирках учитывают пред­варительный результат в тот же день и окончательный - через восемнадцать - двадцать четыре часа. Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бу­мажке через 30-60 секунд.

Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Перечислите принципы и методы получения изолированных колоний аэробов. Методы выделения чистых культур анаэробов. Описать по дням метод Вейнберга.

Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Боль­шинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, ес­тественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроор­ганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохими­ческие и другие свойства микробов, необходимо получить чистую куль­туру. Обычно культурой микробов называют скопление их на пи­тательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) рос­та или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чи­стая культура - это культура микробов одного вида, полученная из од­ной колонии. В лабораториях для различных исследований применя­ют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в опре­деленное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения актив­ности пенициллина.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, ок­рашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего пита­тельного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют остав­шуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на тре­тьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наи­меньшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изоли­рованные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од­ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер­вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре­тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су­точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непроз­рачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отби­рают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным пита­тельным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бак­терий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных пита­тельных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные коло­нии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кру­жевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми края­ми, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окисли­тельно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз пу­тем удаления кислорода физическими, химическими или биологичес­кими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно мож­но заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, угле­кислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Сре­да Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами ана­эробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают хи­мические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Пет­ри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород погло­щается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В даль­нейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания ага­ра в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извле­кают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (спо­соб Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные ко­лонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера).

Применяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды микроорганизмов различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав ДДС входят:

1. Питательная основа, обеспечивающая размножение микроорганизмов

2. Определенный углевод - лактоза

3. Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге pH среды в кислотную сторону, вследствие ферментации соответствующего углевода.

ДДС активно применяются для дифференциации видов микроорганизмов семейства кишечных.

Элективные питательные среды

Предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологических особенностей, которые отличают микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации соли, холерного вибриона - в щелочной среде.

Разлив сред

1. Агаровых сред в чашки Петри:

а) расплавить на водяной бане, остудить до 45-50ºС с МПА

б) поставить чашку крышкой вверх

в) сосуд до средой взять в правую руку, держа его у огня

г) левой рукой вынуть пробку, зажав ее мизинцем и ладонью

д) обжечь горлышко бутылки со средой и двумя пальцами левой руки слегка приоткрыть крышку

е) ввести под нее горлышко бутыли, не касаясь им края чашки и налить 15-20 мл. среды.

Если посев проводят в день разлива среды, то её необходимо подсушить в термостате 20-30 минут в разобранном виде, открыто стороной вниз. Если посев проводят на следующий день, то чашки не подсушивая заворачивают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали и помещают в холодильник.

2. Агаровых среда в пробирки:

а) взять сосуд с расплавленной и остуженной до 45ºС средой

б) левой рукой взять пробирку

в) правой рукой извлечь пробку из пробирки, а левой рукой из сосуда со средой, зажав ее мизинцем и ладонью

г) обжечь края пробирки и сосуда со средой, внести в пробирку 3-5 мл среды

д) вновь обжечь горлышки емкостей, закрыть из пробками

Агаровые среды могут застывать в пробирках в виде:

1. Скошенного столбика

2. Комбинированного столбика

3. Столбика

Для получения скошенного и комбинированного столбика, пробирки с расплавленной агаровой массой укладывают в наклонном положении на специальную подставку, чтобы среда не заходила на 2/3 пробирки, не смачивала пробку. После застывания среды, пробирки ставят вертикально в штатив, дают стечь конденсату вниз. Пользоваться средой без конденсата нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Мясо-пептонный агар

Среда Эндо . К 100 мл нейтрального расплавлен­ного 3%-ного мясопептонного агара прибавляют 1 мл 10%-ного водного раствора кристаллического углекисло­го натрия, выдерживают в текучепаровом аппарате в те­чение10 мин при температуре 100° С, охлаждают до 60° и стерильно прибавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, и смесь фуксина с безводным сульфитом натрия. Смесь готовят следую­щим образом. Растворяют 0,5 г сульфита натрия в 5 мл стерильной воды и добавляют к 1 мл насыщенного спир­тового раствора основного кристаллического фуксина до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка розоватой. Обесцвеченную смесь фуксина с сульфитом добавляют к расплавленному агару, и последний прини­мает розоватый цвет. После тщательного перемешивания (следят за тем, чтобы не образовывалась пена) среду разливают по чашкам. При остывании среда делается цветной, в толстых слоях имеет розоватый оттенок. На этой среде можно легко отличить кишечную палочку, паратифозных бактерий.

Готовят среду перед посевом. Во избежание покраснения ее защищают от света. Выпускается в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на этикетке.

Среда Гисса . Для изготовления индикатораАндредэ берут 100 мл дистиллированной воды, 0,5 г фуксина кислого и 16 мл 4%-ного водного раствора едкого натра. Выдержи­вают на водяной бане 10 мин. Хранят в темном месте.

Среду с индикатором Андредэ приготовляют следую­щим образом. Готовят пептонную воду. Для этого берут 1% пептона и 0,5% поваренной соли на определенный объем дистиллированной воды. Кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный складчатый фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2. После подщелачивания 10%-ным раствором NаОН снова кипятят в течение 10 мин, фильтруют и к готовой 1%-ной пептонной воде (рН 7,0-7,2) добавляют 1% индикатора Андредэ. К среде с индикатором добавляют требуемые углеводы или многоатомные спирты в количестве 0,5% - 1% (лак­тозу, глюкозу, сахарозу, маннит, дульцит и др.). Среды разливают по пробиркам, снабженным для учета обра­зования газа бродильными трубочками. Вместо трубо­чек иногда помещают кусочки ваты - 0,02 г на пробир­ку. Проводят дробную стерилизацию при температуре 100° С в течение 20 мин три дня подряд.

Правильно приготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет.

Среда Кесслера . В 1 л водопроводной воды вносят 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Кипятят на водяной бане 15 мин, постоянно взбалтывая. После полного растворения среду фильтруют через вату и добавляют 10 г лактозы. Доводят рН до 7,7. К 1 л среды добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливают в пробирки с поплавками. Стерили­зуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

Определение рН питательных сред

Для культивирования микробов на искусственных питательных средах особое значение имеет концентрация водородных ионов, так как каждый вид микроба может развиваться только при определенной кислотности или щелочности. Большинство бактерий приспособлено к росту и размножению в нейтральной или слабощелочной среде (рН 7,0-7,6).

Для определения реакции питательной среды применяют два метода: электрометрический (с помощью рН-метра) и колориметрический. В лабораторной прак­тике чаще всего используется наиболее простой колориметрический метод по Михаэлису, основанный на изменении цвета индикатора вследствие диссоциации его в зависимости от концентрации водородных ионов в среде. При определении рН по Михаэлису применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Ввиду того, что для выращивания микробов готовят среды слабощелочной реакции, при определении рН среды в качестве индикатора используют метаннитрофенол, который позволяет определять рН в пределах от 6,8 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Контрольные вопросы :

Состав питательных сред.

Как культивируют в лабораторных условиях микроорганизмы?

Какие бывают питательные среды по консистенции?

Как различают питательные среды по происхождению?

Плотные питательные среды и их характеристика.

Сухие питательные среды и их характеристика.

Углеводные питательные среды, их характеристика.

Автоклавирование.

Стерилизация текучим паром.

Пастеризация.

Стерилизация фильтрованием.

Как готовят МПБ, МПЖ, МПА?

Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО 2 , СН 4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными - с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.

Сухие среды. Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.

Питательные среды - биологические препараты, используемые для выращивания микроорганизмов и изучения культуральных, биохимических, антигенных свойств, фаголизабельности и чувствительности к антибиотикам.

Питательные среды широко используют в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также для контроля за стерильностью лекарственных средств. Для того чтобы микроорганизмы росли и развивались, питательные среды должны отвечать следующим требованиям.

1. Оптимальный состав. В их состав должны входить все необходимые компоненты, которые нужны для развития микробов: белки, витамины, углеводы, минеральные вещества.

2. Оптимальное значение pH. Большинство микроорганизмов развивается при pH 7,2…7,4.

3. Стерильность. Она необходима для того, чтобы избегать конкурентной борьбы между микробами.

4. Прозрачность. Для лучшего изучения характера микробных колоний.

5. Влажность. Питание и дыхание осуществляются путем осмоса и диффузии, поэтому питательные среды должны быть слегка влажными.

Классификация сред . Питательные среды подразделяют по следующим признакам.

1. По консистенции: а) плотные (твердые) - агара 1,2…2 % (мясопептонный агар); б) полужидкие - агара 0,2…0,3 % (полужидкий агар); в) жидкие - мясопептонный бульон.

Для придания средам плотной или полужидкой консистенции чаще всего используют агар-агар - полисахарид, выделяемый из морских водорослей. Агар способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80…100 °С и затвердевающий при 37…40 °С. Устойчивость агара к разжижающему действию большинства микроорганизмов, а также способность образовывать прочные студни обусловили его широкое применение в бактериологии.

2. По происхождению: а) искусственные: животного (МПА, МПБ) и растительного происхождения (пивное сусло); б) естественные: животного (кровь, молоко) и растительного происхождения (кусочки картофеля).

3. По составу: а) белковые; б) безбелковые; в) минеральные.

4. По назначению: а) среды для культивирования (простые, специальные); б) среды для обогащения (для накопления микроорганизмов при их низкой концентрации в исходном материале); в) среды консервирующие для первичного посева и транспортировки патогенов; г) среды для идентификации (дифференциально-диагностические) - микробы одного вида образуют колонии, отличающиеся по внешнему виду от колоний других микроорганизмов.

Если материал слабо загрязнен посторонней микрофлорой, то для выделения культур применяют простые среды общего назначения (МПА), при обильной контаминации сапрофитами используют специальные среды: элективные (для отдельных видов) и дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации).

Характеристики сред . Консервирующие транспортные среды (глицериновая смесь, фосфатный буфер, тиогликолевая среда для анаэробов и др.). Предупреждают отмирание патогенных микробов и подавляют рост сапрофитов.

Среды обогащения (селективный бульон, желчный бульон, среда Мюллера, Раппопорт, среда Кауфмана, щелочная пептонная вода). Применяют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто используют различные красители и химические вещества - соли, желчные кислоты, теллурит калия, антибиотики, фуксин и т. д.

Элективные (селективные среды) . Обеспечивают более благоприятные условия для изолируемого микроба с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры. Например, среды Плоскирева и солевой агар применяют для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры.

Дифференциально-диагностические среды . Предназначены для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.

Среды для выявления протеолитической, гемолитической способности микробов . Содержат в своем составе белковые вещества (кровь, молоко, желатин и др.).

Среды с индифферентными химическими веществами . Служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами (цитратный агар Симмонса).

Среды с углеводами (моносахариды, дисахариды, полисахариды), многоатомными спиртами (сорбит, маннит), гликозидами (салицин, инозит) для обнаружения соответствующих ферментов.

Среды для определения редуцирующей способности микробов . В своем составе содержат краски, обесцвечивающиеся при восстановлении (агар Омелянского с индигокармином), а также нитраты для определения денитрифицирующей способности микроорганизмов.

Сухие питательные среды . В бактериологических лабораториях используют в основном коммерческие сухие среды. Они представляют собой высушенные и измельченные до порошкообразного состояния готовые питательные среды. У сухих сред имеется ряд преимуществ перед средами обычного изготовления: их можно хранить длительно в сухом затемненном помещении в герметически закрытой таре, они транспортабельны, удобны в применении и стандартны, что облегчает получение сравнимых результатов при бактериологическом исследовании.

Плотные среды состоят из питательной основы, агар-агара, индикаторов и других органических и минеральных веществ, улучшающих рост одних и задерживающих рост других микроорганизмов.

В качестве питательной основы сухих сред используют различные источники белка. За рубежом сухие среды чаще всего изготавливают на мясопептонном бульоне, требующем большого расхода говяжьего мяса. В нашей стране в качестве источника белка используют гидролизаты кильки, казеина, кормовых дрожжей.

Для упаковки сухих питательных сред используют стеклянные банки из оранжевого стекла (250 г), полиэтиленовые банки (250, 500, 1000 г), а также пакеты из трехслойной ламинированной бумаги (50…200 г). Сроки хранения в стеклянных и полиэтиленовых банках составляют 2…4 года, а в пакетах из трехслойного ламината - от 1 года до 4 лет.

Отечественная промышленность выпускает более 120 наименований различных сухих питательных сред. Крупнейшими производителями являются ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ГНЦПМ (г. Оболенск) (Меджидов М. М. Справочник по микробиологическим питательным средам. - М.: Медицина, 2003). Наиболее часто применяют в практических лабораториях следующие среды.

Сухие дифференциально-диагностические среды . Если раньше в практике ветеринарных бактериологических лабораторий для идентификации микроорганизмов широко использовались среды Гисса, содержащие какой-либо одни углевод, то в последнее время все шире стали применяться среды, позволяющие дифференцировать микроорганизмы по двум-трем признакам.

Среда Росселя (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет зеленый цвет. После посева культуры через 18…20 ч инкубации при 37 °С о ферментации лактозы судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы - по желтой окраске столбика агара. О газообразовании заключают по появлению пузырьков, разрывам агара. Если микроорганизм не ферментирует глюкозу и лактозу, то среда остается зеленой или приобретает синий цвет.

Среда Клиглера (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала и АООТ «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет красный цвет. Скашивать необходимо так, чтобы остался столбик высотой 2.5…3 см. Посев производят сначала в толщу среды, а затем по скошенной поверхности. Через 18…20 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты. Если микроорганизм ферментирует лактозу, то скошенная часть агара приобретает желтый цвет. При сбраживании глюкозы среда желтеет в столбике. При газообразовании - появление пузырьков и разрывы агара. В случае образования сероводорода среда приобретает черный цвет. Продуцирование индола определяют при помощи специальных индикаторных бумажек.

Двухслойный железоглюкозолактозный агар с мочевиной . Среда Олькеницкого (ФГУП НПО «Питательные среды»). Эти среды позволяют идентифицировать бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу, образовывать сероводород и расщеплять мочевину. С подробной инструкцией о приготовлении, способе посева микроорганизмов и учете результатов можно ознакомиться в «Справочнике по микробиологическим питательным средам» М. М. Меджидова.

Сухие элективные питательные среды . Элективный солевой агар (СА) (ФГУП НПО «Питательные среды» и ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь). Предназначен для выделения стафилококков из исследуемого материала. Может служить основой для приготовления желточно-солевого или молочно-солевого агара. При посеве материала на СА через 48 ч инкубации при 37 °С рост стафилококков в виде круглых колоний диаметром 2…4 мм.

Элективно-питательная среда для выделения пневмококка (пневмококк-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для элективного выделения пневмококка из патологического материала (крови, мокроты, гноя). Готовая среда имеет коричневый цвет. Через 24…48 ч после посева материала и инкубации его при 36…38 °С в условиях «свечного сосуда» пневмококк образует на среде выпуклые колонии размером до 1 мм, хорошо отличимые от бледно-розовых колоний стафилококка.

Питательная среда для изоляции грибов рода Candida (кандида-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала). Предназначена для выделения грибов рода Candida из инфицированного материала и объектов внешней среды. Среда не подлежит автоклавированию. Грибы рода Candida на этой среде через 22…24 ч инкубации при 37 °С образуют плотные выпуклые или плоские колонии сметанообразной консистенции с ровными или волнистыми краями размером 1…2 мм.

Среда подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры (кишечной палочки, протея, стафилококка).

Селективный агар для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий в моче (аналог агара Мак-Конки) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Рекомендуется для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий из мочи, а также может быть использован при бактериологическом исследовании пищевых продуктов, фекалий, сточных вод.

Готовая среда красно-коричневого цвета, прозрачная, с легкой опалесценцией. Через 16…20 ч инкубации посева при 37 °С лактозоотрицательные сальмонеллы образуют прозрачные бесцветные колонии, лактозоположительные эшерихии - колонии ярко-малинового цвета. Среда подавляет «роение» протеев, которые растут в виде бесцветных изолированных колоний в О-форме. Рост стафилококков полностью подавляется.

Питательные среды других групп . Гликолевая среда (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала; ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для контроля стерильности медицинских и биологических препаратов. Учет результатов проводят согласно инструкции «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту».

Питательные среды № 1 и 2 выпускают ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).

Питательная среда для контроля микробной загрязненности сухая № 1 . Используют для определения общей обсемененности нестерильных лекарственных препаратов и пищевых продуктов.

Питательная среда для контроля микробной загрязненности (Сабуро-агар) № 2 . Рекомендуется для культивирования грибов, а также определения содержания грибов в нестерильных лекарственных средах и других объектах внешней среды.

Эритрит-агар и эритрит-бульон . Предназначен для выделения и культивирования бруцелл.

Питательная среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба .

Кетоглутаровый агар . Эффективен для изоляции и культивирования возбудителя туляремии.

Среда АГВ . Предложена для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам дискодиффузным методом.

Питательная среда для экспресс-определения антибиотикочувствительности условно-патогенных бактерий . Предложена для ускоренного определения антибиотикочувствительности грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов. Учет результатов можно проводить через 4…5 ч.

Ассортимент выпускаемых отечественной промышленностью сухих питательных сред постоянно расширяется. Приведено лишь небольшое количество тех, которые могут быть использованы в повседневной работе ветеринарных лабораторий. Кроме того, в настоящее время имеется возможность приобретать и импортные питательные среды. Коммерческие названия можно узнать, заказав соответствующие каталоги. Однако их внедрение и широкое использование в ветеринарных лабораториях РФ возможно лишь в отдаленной перспективе из-за довольно высокой стоимости. Кроме того, в этой главе не упомянуты готовые коммерческие питательные среды довольно хорошего качества производства НИЦФ (г. Санкт-Петербург). Они расфасованы во флаконы по 400 мл; срок хранения 1 год. Среды, безусловно, могут быть полезны при проведении бактериологических работ в полевых условиях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .